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Willkommen auf der Novus Visuelle Protocol Series.
In diesem Video werden wir lernen, wie man alle Phasen eines Western Blot mit der Durchführung
gängigsten Methoden für diesen Test.
Bevor wir beginnen können, die Vorbereitung der Blot, müssen wir zuerst bereiten unsere Probenlysat.
In diesem Beispiel erstellen wir eine Proteinlysatpräparation aus kultivierten Zellen.
Hier
Wir waschen die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS
und genug Lysepuffer zur Deckung der Zellen.
Die Wahl der Lysepuffer hängt weitgehend von Ihrem
Wahl des Proteins von Interesse.
Wir kratzen die Zellen und überweisen Sie den Zell-Lösung auf einem Zentrifugenröhrchen
auf Eis gestellt.
Um membrangebundene Proteine löslich zu machen, benötigen wir stärker
Extraktion Reinigungsmittel zur isolierten zytoplasmatischen Proteine verglichen.
In diesem Beispiel
Wir sind mit einem Standard-RIPA-Puffer,
das ist ein gemeinsamer Puffer für den Erhalt maximale Ausbeute an Protein. Beim Extrahieren
Proteine aus aller zellulären Lokalisationen,
es ist sehr wichtig, Protease-Inhibitoren in Ihrem Lysepuffer gehören Welche wird
eine Verschlechterung Ihrer Probe. Immer frisch zubereitet Protease
Inhibitoren, halten Proben auf Eis und arbeiten schnell.
Wir Läusen die Zellen durch Auf-und Abpipettieren
gefolgt durch Inkubation auf Eis für dreißig Minuten.
Dann zentrifugiert, die Zellen zu einem Pellet.
Entsorgen Sie die Pellets und den Überstand. Dies Ihr Lysat.
Bestimmen Sie die gesamte Konzentration des Proteins Lysat durch
Testen einer kleinen Teil Ihrer Lysat
mit einem handelsüblichen Proteinquantifizierung Assay
wie dem BCA.
Dadurch werden Sie beim Laden der gleiche Mengen an Protein in das Gel zu unterstützen.
Western Blots sind traditionell unter vorgeformt reduzierten und denaturierten
Bedingungen. Diese Bedingungen ermöglichen Proteine getrennt zu sein durch ihre
Molekulargewicht
eher als ihre einheimischen Konformationsänderungen Form oder Ladung.
Zu reduzieren und zu denaturieren Proben,
verdünnen jeweils in einem Ladepuffer wie die traditionellen Laemmli-Puffer.
Dieser Puffer enthält beta-Mercaptoethanol oder DTT, zu Disulfid Rücken zu reduzieren
zwischen Cysteinen
SDS zu unterstützen Denaturierung eine negative Protein,
Glycerin, damit die Proben in jede Vertiefung sinken,
Bromphenolblau zu visualisieren des Lysats und einen ikonischen Puffer.
Votex jede Probe und Inkubation bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten
Denaturierung der Proteine vollständig. Sie sind jetzt bereit, Ihre Proben in einem Laden
in einem SDS-PAGE-Gel.
Aus diesem nächsten Schritt werden wir die einzelnen Proteine in unserer Stichprobe trennen
Lysat
basierend auf ihrem Molekulargewicht
Verwendung einer positiven Elektrode, um ein negativ geladenes Protein zu gewinnen.
Dazu
laden wir unsere zuvor hergestellte Protein-Proben in ein kommerziell erhältliches
Polyacrylamidgel.
Gele sind in festen Prozentsätzen oder Gradienten von Acrylamid Verfügung.
Je höher die Acrylamid je kleiner der Anteil an Gel
Prozentsatz.
Deshalb höheren Prozentsatz Gele sind besser für geringes Gewicht Proteine, geringen Prozentsatz
Gele sind besser für große Gewicht Proteine und Gradientengelen kann verwendet werden für
Proteine aller Größen
aufgrund ihrer unterschiedlichen Bereich der Porengröße.
Bereiten Sie Ihre Gel durch Einsetzen in die Elektrophorese-Vorrichtung und
Befüllung mit Laufpuffer, die für Ihre Gel-Chemie ist.
Spülen Sie die Vertiefungen des Gels mit Laufpuffer und fügen Puffer, um die
Kammern.
Legen Sie Ihre Proben in die Vertiefungen.
Wenn Sie unsicher sind, den Betrag zu laden sind,
10-30 Mikrogramm Gesamt-Protein ist ein Vorschlag Ausgangspunkt
sowie die gesamte Menge der Probe beladen.
Sie müssen auch mindestens ein gut behalten für prestained Molekulargewicht
Leiter.
Die Leiter können Sie Protein-Trennung während der Überwachung
Elektrophorese und anschließend zu überprüfen protein Gewicht in Ihrer Probe während
spätere Analyse.
Schließen Sie das Elektrophorese-Einheit und an die Stromversorgung anschließen. Die meisten Einheiten
Regel laufen 45-60 Minuten bei 200 Volt
oder bis der Ladepuffer erreicht den Boden des Gels.
Während dieser Zeit werden die negativ geladenen Proteine in jeder Probe wird zur Migration
Die positiv geladenen Elektrode, die ihren Weg durch die Polyacrylamid
Gelmatrix.
Im nächsten Schritt werden wir unsere separate Proteine aus dem Gel zu übertragen
und in eine feste Membran oder Blot.
Dies basiert auf dem gleichen Prinzip wie im vorherigen Schritt basiert
in dem ein elektrisches Feld aufgeladen, um die negativen Proteine zu entfernen
in Richtung einer positiven Elektrode.
Die Übertragung kann unter nassen oder halbtrockenen Bedingungen auftreten.
Hier zeigen wir Ihnen die traditionelle nassen Übertragungsmethode. Starten Sie, indem
das Gel aus seiner Kassette
Schneiden des oberen Abschnitts mit dem Brunnen.
Notch die linke obere Ecke angegebenen Gel Orientierung.
Schwimmer das Gel in Transferpuffer während der Vorbereitung der Übertragung Sandwich.
Um den Transfer Sandwich zu machen
Sie benötigen eine Kassette,
Schwamm, Filterpapier
das Gel
und Ihrer Wahl entweder PVDF oder nitrocellulous Membran.
PVDF muss zuerst durch Einweichen der Membran in Ethanol aktiviert werden
zwei Minuten. Aber anders als diese die PVDF oder Wahl des nitrocellulous
Membran ist eine persönliche Präferenz.
Notch die linke obere Ecke Blot Orientierung geben
und inkubieren Membranen in Transfer Puffer für 10 Minuten.
Erstellen Sie einen Stapel, indem Sie die folgenden Komponenten
aus dem schwarzen negativen Kathode auf rot positive Anode:
Schwamm,
Filterpapier,
Membran,
(Achten Sie darauf, das Gel oder die Membran mit bloßen Händen berühren und benutzen
saubere Pinzette oder Spachtel statt.
Das Berühren der Membran während jeder Phase kontaminieren können den Blot und führen zu
übermäßige Hintergrundsignal. ),
Filterpapier
und Schwamm.
Verwenden Sie ein sauberes Walze mit jeder Schicht, sanft rollen keine Blasen, kann
präsentieren
Seit Blasen verhindern effiziente Protein übertragen.
Verriegeln Sie die Kassette und legen Sie sie in das Gerät mit kaltem
Transfer-Puffer
Sicherstellung, dass die Kassette richtig von negativ zu positiv positioniert.
Um einen Wärmestau zu verhindern, ist es vorteilhaft, mit einem kalten transferieren
packen in der Vorrichtung
Vorrichtung oder in einem kalten Raum mit der Schleudereinrichtung bar am Boden der Kammer angeordnet.
Schließen Sie das Fach, und schließen Sie an eine Stromversorgung.
Führen Sie die Übertragung nach den Anweisungen des Herstellers was
normalerweise 100 Volt für 30 bis 120 Minuten.
Nach Elektrotransfer der Proteine auf eine Membran, werden wir
Jetzt blockieren die Blot,
Anwendung eines primären Antikörpers, der spezifisch für unsere Protein von Interesse und dann ein sekundäres
Antikörper, der den primären Antikörper erkennt.
Als erstes wird die Membran aus der Kassette und dreimaligem Spülen in Wasser.
Als optionalen Schritt können wir überprüfen, die Proteine erfolgreich übertragen wurden
durch Färben der Membran mit Ponceau rot.
Inkubieren Sie die Membran in Ponceau für fünf Minuten und mit Wasser gewaschen, bis
die Bänder sind klar.
Nach Überprüfung
Der Blot kann dann durch die weitere Zusammenarbeit mit Wasser waschen DE-gefärbt werden
oder TBS Garn
bis der Farbstoff vollständig entfernt wird.
Wir müssen alle Bereiche des Blots, die keine Protein blockieren.
Dies verhindert die unspezifische Bindung des Antikörpers und die Gesamtkosten
Hintergrundsignal.
Gemeinsame blockierende Puffer umfassen 5% fettfreier Trockenmilch für den Assay
in einer TBS Garn Lösung.
Allerdings nicht mit Milch, wenn Sondieren mit phospho-spezifischen Antikörpern
da es hohen Hintergrund von seiner endogenen Phosphoprotein verursachen, Cäsium.
Inkubieren der Membran mit Blockierlösung für eine Stunde bei Raumtemperatur
Temperatur
unter leichtem Schütteln.
Dekantieren Blocking-Lösung und waschen mit TBS Garn für fünf Minuten.
Wir sind nun bereit, unser Antikörper hinzuzufügen. Verdünnen des primären Antikörpers in einem
Blocking-Puffer bei der Konzentration auf dem Datenblatt empfohlen.
Inkubieren über Nacht bei 4 Grad Celsius unter leichtem Schütteln.
Eine empfohlene optional Schritt ist, um auch eine positive Kontroll-Antikörper
welche ermöglicht es dem Benutzer, um gleiche Mengen an Gesamtprotein zu überprüfen geladen wurden in
jede Vertiefung und Helfer bei der Fehlersuche, indem jede
Unsicherheiten im Zusammenhang mit der Western Blot Verfahren.
Am nächsten Tag
dekantieren Sie den primären Antikörper und waschen Sie die Membran mit großen Mengen
TBS Zwirn und kräftigem Rühren
fünf Mal für jeweils fünf Minuten.
Diese strengen Wäschen sind extrem wichtig für das Entfernen nicht-spezifische
Hintergrund Signale.
Nach dem Waschen, verdünnen Sie die sekundären Antikörper in Blockierungslösung inkubieren
die Membran für eine Stunde bei Raumtemperatur in der Konzentration
empfohlen auf dem Datenblatt.
In unserem Beispiel ist die sekundäre ist auch konjugiert mit HRP für eine spätere
Detektion.
Dekantieren Membran und waschen sekundäre mit großen Mengen von TBS Garn mit
kräftigem Rühren fünf Mal für jeweils fünf Minuten.
Sie sind nun bereit für den Nachweis Phase.
In dieser letzten Phase werden wir zeigen, Signal-Entwicklung mit den gebräuchlichsten
empfindlichste und kostengünstigste Nachweismethode die Elektrochemilumineszenz
(Oder ECL) Reaktion.
Diese Methode nutzt das HRP-Enzym,
die konjugiert wurde zu der sekundären um die ECL-Reaktion katalysieren und produzieren
Licht.
Ein Licht wird dann auf einem Röntgenfilm entwickelt gesammelt und
oder mit Hilfe einer speziellen Kamera empfindlich genug digitalisiert
für diese Anwendung.
Wir starten durch Mischen gleicher Teile ECL Reagenzien in einer Eins-zu-eins-Verhältnis
gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Wir werden die Membran für 3-5 Minuten ohne Schütteln inkubieren.
Nach der Inkubation dekantieren ECL Mischung und mit einem Labor-wischen, wischen Sie überschüssige
Lösung von der Ecke der Membran.
Legen Sie die Membran in einer Klarsichtfolie wie eine Klarsichthülle zu verhindern
Trocknen. Vermeiden Sie, dass die Membran vollständig austrocknet.
Wir können nun eine Rolle zu verdrängen keine Blasen oder überschüssige Lösung.
Unmittelbar Entwicklung der Membran.
Beide Film-und Kamera-Systeme ermöglichen Ihnen die manuelle Einstellung der Belichtungszeit
um ein perfektes Bild Western Blot zu gewährleisten.
Relative Band Dichten kann nun mit handelsüblichen quantifiziert werden
Software.
. Ordnungsgemäße Molekulargewicht kann auch durch Vergleichen der Größen der Banden nachgewiesen werden
Molekulargewicht Leiter.