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Mit den Zellen am Vortag und über Nacht ausplattiert, sind wir bereit,
mit dem IStGH zu starten.
An diesem ersten Tag des ICC, werden wir beheben,
permeabilisieren,
auslöschen und fügen Sie einen primären Antikörper zu den Zellen.
Starten Sie durch Absaugen Kulturmedium aus jedem Well gefolgt von Fixierung der
Zellen mit 4% Formaldehyd oder 10% Formalin
10 Minuten bei Raumtemperatur.
Absaugen Fixiermittel und spülen Sie jedes Well zweimal mit eiskaltem PBS.
Seien Sie vorsichtig, nicht zu lassen, die Zellen austrocknen in diesem
oder jeder weiteren Schritt des Protokolls.
Wenn das Epitop des Protein von Interesse intrazellulär exprimiert,
zellulären Permeabilisierung ist notwendig für die Antikörper Zugriff auf die Verstärkung auf
Zelle.
Obwohl es viele verschiedene Permeabilisierung Mitteln, die häufigste
sind 0,1 bis 0,5% iger Konzentration von Tween-20 oder
Triton-X100
verdünnt in PBS.
Tween-20 ist für Epitope in Zytoplasma verwendet
während Triton-X100 wird zur Permeabilisierung der Kern und Mitochondrien verwendet.
Inkubieren Vertiefungen mit Permeabilisations-Puffer für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
Absaugen Permeabilisierung-Puffer und dreimal für 5 Minuten
jeweils mit PBS Schnur.
PBS Garn enthält 0,1% Tween-20.
Wir werden jetzt zu blockieren unspezifischer Bindungsstellen mit Blocking-Puffer für 1 Stunde
bei Raumtemperatur.
Die beste Blockpuffer wird PBST mit 10% Serum aus der
Wirtsarten Ihrer sekundären Antikörper.
Jedoch kann 1% BSA in PBST ebenfalls verwendet werden.
Vorbereiten des primären Antikörpers durch Verdünnen in Blocking-Puffer in der empfohlenen
Verdünnung auf dem Datenblatt angegeben.
Mehrere enger Verdünnungen vorteilhaft sind zu berücksichtigen Variablen,
kann in Ihrem Test anders und
für die Erreichung der besten Ergebnisse.
Inkubation bei 4 Grad Celsius über Nacht.
In unserem Beispiel wird, da wir die Verwendung eines primären sind unkonjugiert verwenden wir einen Fluorophor
konjugierten sekundären am zweiten Tag.