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Nach Elektrotransfer unserer Proteine auf eine Membran, werden wir nun blockieren die
auslöschen,
Anwendung eines primären Antikörpers, der spezifisch für unsere Protein von Interesse und dann ein sekundärer Antikörper
das erkennt den primären Antikörper.
Als erstes wird die Membran aus der Kassette und dreimaligem Spülen in
Wasser.
Als optionalen Schritt können wir überprüfen, die Proteine erfolgreich übertragen wurden
durch Färben der Membran mit Ponceau rot.
Inkubieren Sie die Membran in Ponceau für fünf Minuten und mit Wasser gewaschen, bis
die Bänder sind klar.
Nach Überprüfung der Blot kann dann de-gefärbten durch die Fortsetzung zum Waschen
Wasser oder TBS Bindegarn bis der Farbstoff vollständig entfernt wird.
Wir müssen alle Bereiche des Blots, die nicht bereits enthalten Protein blockieren.
Dies verhindert die unspezifische Bindung des Antikörpers und die Gesamtkosten
Hintergrundsignal.
Gemeinsame blockierende Puffer umfassen 5% fettfreier Trockenmilch für den Assay
in einer TBS Garn Lösung.
Allerdings nicht mit Milch, wenn Sondieren mit phospho-spezifische Antikörper, wie sie können
verursachen hohe Hintergrund aus seiner endogenen Phosphoprotein, Cäsium.
Inkubieren der Membran mit Blockierlösung für eine Stunde bei Raumtemperatur
unter leichtem Schütteln.
Dekantieren Blocking-Lösung und waschen mit TBS Garn für fünf Minuten.
Wir sind nun bereit, unser Antikörper hinzuzufügen. Verdünnen des primären Antikörpers in einem
Blocking-Puffer bei der Konzentration auf dem Datenblatt empfohlen.
Inkubieren über Nacht bei 4 Grad Celsius unter leichtem Schütteln.
Eine empfohlene optional Schritt ist, um auch eine positive Kontrolle geladenen Antikörper
welche ermöglicht es dem Benutzer, um gleiche Mengen an Gesamtprotein zu überprüfen wurden in jedes geladenen
gut und Helfer bei der Fehlersuche, indem Sie alle Unsicherheiten
mit der Western-Blot-Verfahren. Am nächsten Tag abgießen aus dem primären Antikörper und
Waschen Sie die Membran mit großen Mengen von TBS Zwirn und kräftigem Rühren
fünf Mal für jeweils fünf Minuten.
Diese strengen Wäschen sind extrem wichtig für das Entfernen nicht-spezifische
Hintergrund Signale.
Nach dem Waschen verdünnt das sekundäre Antikörper in Blocking-Lösung und
Inkubieren der Membran für eine Stunde bei Raumtemperatur in der Konzentration
empfohlen auf dem Datenblatt.
In unserem Beispiel ist die sekundäre ist auch konjugiert mit HRP für eine spätere
Detektion.
Dekantieren Membran und waschen sekundäre mit großen Mengen von TBS Garn mit
kräftigem Rühren fünf Mal für jeweils fünf Minuten. Sie sind nun bereit für die
Erkennungsphase.