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Willkommen auf der Novus Visuelle Protocol Series.
In diesem Video werden wir lernen, wie man alle Phasen eines Western Blot mit der Durchführung
gängigsten Methoden für diesen Test.
Bevor wir beginnen können, die Vorbereitung der Blot, müssen wir zuerst bereiten unsere Probenlysat.
In diesem Beispiel erstellen wir eine Proteinlysatpräparation aus kultivierten Zellen.
Hier waschen die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS und genügend Lysepuffer
um die Zellen zu decken.
Die Wahl der Lysepuffer hängt weitgehend von der Lokalisation
Ihrer Protein von Interesse.
Wir kratzen die Zellen und überweisen Sie den Zell-Lösung auf einem Zentrifugenröhrchen
auf Eis gestellt.
Um membrangebundene Proteine löslich zu machen, benötigen wir stärker
Extraktion Reinigungsmittel zur isolierten zytoplasmatischen Proteine verglichen.
In diesem Beispiel verwenden wir ein Standard-RIPA-Puffer ist, die eine häufige Pufferüberlauf
für den Erhalt maximale Ausbeute an Protein. Während Extraktion von Proteinen aus allen
zelluläre Lokalisationen,
es ist sehr wichtig, Protease-Inhibitoren in Ihrem Lysepuffer gehören Welche wird
eine Verschlechterung Ihrer Probe. Immer frisch zubereitet Protease
Inhibitoren, halten Proben auf Eis und arbeiten schnell.
Wir Läusen die Zellen durch Auf-und Abpipettieren
gefolgt durch Inkubation auf Eis für dreißig Minuten.
Dann zentrifugiert, die Zellen zu einem Pellet.
Entsorgen Sie die Pellets und den Überstand. Dies Ihr Lysat.
Bestimmen Sie die Gesamt-Protein-Konzentration Ihrer Probe Lysat durch
Testen eines kleinen Teils des Lysats mit einem kommerziell erhältlichen Protein
Assay Quantifizierung wie dem BCA.
Dadurch werden Sie beim Laden der gleiche Mengen an Protein in das Gel zu unterstützen.
Western Blots sind traditionell unter vorgeformt reduzierten und denaturierten
Bedingungen.
Diese Bedingungen erlauben Proteinen getrennt zu sein durch ihr Molekulargewicht
eher als ihre einheimischen Konformationsänderungen Form oder Ladung.
Zu reduzieren und zu denaturieren Proben,
verdünnen jeweils in einem Ladepuffer wie die traditionellen Laemmli-Puffer.
Dieser Puffer enthält beta-Mercaptoethanol oder DTT, zu Disulfid reduzieren
Grate zwischen Cysteinen
SDS zu unterstützen Denaturierung a einen negativen Netto-Protein,
Glycerin, damit die Proben in jede Vertiefung sinken,
Bromphenolblau das Lysat visualisieren
und eine Ikone Puffer.
Votex jede Probe und Inkubation bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten
Denaturierung der Proteine vollständig. Sie sind jetzt bereit, Ihre Proben in einem Laden
SDS-Page-Gel.