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Willkommen auf der Novus Visuelle Protocol Series.
In diesem Video erfahren Sie, wie Sie alle Phasen des florescent durchführen
Immunzytochemie
mit den am häufigsten verwendeten Methoden für diesen Test.
Vor dem Start der ICC Verfahren, werden wir zeigen, wie man sich vorbereiten
Deckgläser und Zellkultur-Platten, gefolgt von der Beschichtung von unseren Zellen.
Wir beginnen mit der Säurebehandlung neue Deckgläser in einem Backenzahn Salzsäure für
24 Stunden.
Nach sorgfältiger Abdekantieren der Säure und Entfernen der Deckgläser,
waschen wir jeweils mit destilliertem Wasser,
dann ein Finale mit Ethanol spülen.
Als optionalen Schritt können Sie die Deckgläschen in eine Unterschicht Rack platzieren
Tauchen Sie es
a 0,1 mg / Lösung Gelatine oder Polylysin
für fünf Minuten.
Diese Beschichtungen aide in zusätzliche Adhärenz von Zellen, um das
Deckgläser
sicherzustellen, dass sie nicht während der späteren Waschschritte abgetrennt.
Nach der Behandlung entfernen Sie die Unterschicht Rack und trocknen Sie die Deckgläser in der Kultur
Haube oder ein beheizter Ofen.
Saubere, trockene Deckgläser werden dann in jede Vertiefung einer sechs gut eingeführt
Kulturplatte
und mit einem Deckel bedeckt.
Um Zeit zu sparen, können große Mengen an Platten vor der Zeit für eine spätere Verwendung vorbereitet werden.
Die Platten können auch, indem sie unter der Haube ist UV-Licht sterilisiert werden.
Mit sauberen Deckgläser in sechs Well-Platten hergestellt,
Wir können nun unsere Zellen.
Hier in Zellen platted hinzuzufügen eine Dichte von einer halben Million Zellen pro Vertiefung.
Die Zellen werden dann über Nacht im Brutschrank kultiviert oder bis sie die gewünschte
Dichte.
Mit den Zellen am Vortag und über Nacht ausplattiert, sind wir bereit,
mit dem IStGH zu starten.
An diesem ersten Tag des ICC, werden wir beheben,
permeabilisieren,
auslöschen und fügen Sie einen primären Antikörper zu den Zellen.
Starten Sie durch Absaugen Kulturmedium aus jedem Well gefolgt von Fixierung der
Zellen mit 4% Formaldehyd oder 10% Formalin
10 Minuten bei Raumtemperatur.
Absaugen Fixiermittel und spülen Sie jedes Well zweimal mit eiskaltem PBS.
Seien Sie vorsichtig, nicht zu lassen, die Zellen austrocknen in diesem
oder jeder weiteren Schritt des Protokolls.
Wenn das Epitop des Protein von Interesse intrazellulär exprimiert,
zellulären Permeabilisierung ist notwendig für die Antikörper Zugriff auf die Verstärkung auf
Zelle.
Obwohl es viele verschiedene
Permeabilisierung Mitteln, sind die häufigste von 0,1 bis 0,5%
Konzentration
Tween-20
oder Triton-X100
verdünnt in PBS.
Tween-20 ist für Epitope in Zytoplasma verwendet
während Triton-X100 wird zur Permeabilisierung der Kern und Mitochondrien verwendet.
Inkubieren Vertiefungen mit Permeabilisations-Puffer für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
Absaugen Permeabilisierung-Puffer und dreimal für jeweils 5 Minuten mit
PBS Schnur.
PBS Garn enthält 0,1% Tween-20.
Wir werden jetzt zu blockieren unspezifischer Bindungsstellen mit Blocking-Puffer für 1 Stunde
bei Raumtemperatur.
Die beste Blockpuffer ist PBST mit 10% Serum vom Host
Arten des sekundären Antikörper.
Jedoch
1% BSA in PBST können ebenfalls verwendet werden.
Vorbereiten des primären Antikörpers durch Verdünnen in Blockierungspuffer
in der empfohlenen Verdünnung durch das Datenblatt angegeben.
Mehrere enger Verdünnungen vorteilhaft sind zu berücksichtigen Variablen kann
unterschiedlichen in Ihrem Test
und zur Erreichung der besten Ergebnisse.
Inkubation bei 4 Grad Celsius über Nacht.
In unserem Beispiel
da wir mit einem unkonjugierten primären wir werden mit einem Fluorophor
konjugierten sekundären am zweiten Tag.
In Tag zwei unserer ICC Verfahren
Wir fügen unserer sekundären Antikörper,
führen Sie eine optionale doppelte Kennzeichnung und Kernfärbung Schritt
montieren unsere Deckgläser Dias,
und Abrufen von Bildern der Antikörper mit einem Fluoreszenzmikroskop.
Zuerst haben wir absaugen Primärantikörper-Lösung gefolgt von Waschen der Zellen
dreimal mit PBST für jeweils fünf Minuten.
Weiter bereitet die floraform konjugierten sekundären Antikörper, der an den primären binden
Antikörper.
Verdünnen Sie die sekundäre Blockpuffer
mit dem empfehlen Verdünnung auf dem Datenblatt angegeben
und inkubiert Raumtemperatur für eine Stunde.
Abdecken der Platten mit Folie verhindert empfindlichen Farbstoffe aus entwürdigend.
Absaugen die sekundäre Antikörperlösung durch Waschen der Zellen verfolgt
dreimal mit PBST
für fünf Minuten.
Als optionaler Schritt einen zweiten primären und sekundären Paares eingesetzt werden kann
um ein zweites Epitop visualisieren
durch Verwendung einer anderen Etage dafür.
Darüber hinaus DNA-bindende Farbstoffe wie DAPI
können ohne die Notwendigkeit für sekundäre Antikörper angewendet werden.
Siehe das vollständige schriftliche Novus Protokoll für weitere Anweisungen, wie zu verdoppeln und
Dreifach-Label.
Deckgläser sind nun bereit, auf Objektträgern montiert werden.
Nehmen Sie ein sauberes Rutsche und einen Tropfen des antifade Eindeckmedium durch langsames
Wählen Sie den Kolben der Pipette.
Entfernen Sie vorsichtig ein Deckgläschen aus dem Brunnen,
damit überschüssiges waschen, abtropfen
und legen Sie die Zellen nach unten auf die Folie.
Klare Nagellack kann verwendet werden, um das Deckglas versiegeln und verhindern, dass es zu
Austrocknen.
Dias können nun unter dem Mikroskop sichtbar
oder bei -20 oder 4 Grad Celsius gelagert
in einem dunklen schiebeschachtel oder Dia Buch.
Begrenzung der Höhe der Zeit jeder Folie des Mikroskops Licht ausgesetzt ist, wird aide in
Verlängerung der fluoreszierenden Signals
und verhindert photo Bleichen.